分子診斷基于核酸，主要用于臨床實(shí)驗(yàn)室各種疾病的診斷，如腫瘤、感染、遺傳等。，而核酸提取是分子診斷實(shí)驗(yàn)的“一步”。幾乎所有的實(shí)驗(yàn)都是基于核酸提取，以及后續(xù)的克隆，PCR，q PCR，建庫，測序等。都需要核酸提取才能順利進(jìn)行。核酸的提取純化質(zhì)量是保證核酸檢測數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性的前提，也是分子診斷產(chǎn)業(yè)發(fā)展的前提。今天，邊肖將為您學(xué)習(xí)核酸在各種平臺(tái)中的應(yīng)用以及相應(yīng)的技術(shù)原理。

在PCR技術(shù)中的應(yīng)用

根據(jù)核酸的提取方法不同，可分為磁珠純化法、硅膠膜離心柱法、溶液提取法三大類。隨著2020年新冠肺炎疫情的爆發(fā)，分子檢測從曾經(jīng)的王協(xié)顏飛入尋常百姓家，讓越來越多的人知道了核酸 detection。Q PCR因其特異性強(qiáng)、靈敏度高而成為新冠肺炎核酸檢測中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)。q PCR實(shí)驗(yàn)操作中必不可少的步驟是核酸提取。為防控新冠肺炎疫情，各地開展了大規(guī)模的核酸檢測，其中磁珠法 核酸提取因其速度快、提取濃度高而被廣泛使用。

磁珠法原理:通過納米技術(shù)對(duì)超順磁性納米粒子進(jìn)行表面改進(jìn)和表面修飾(如硅基、氨基、羧基等)后，制備出超順磁性二氧化硅納米粒子。核酸主要通過靜電、疏水、氫鍵等方式與磁珠結(jié)合。在裂解物的作用下，RNA被釋放出來。此時(shí)，磁珠與核酸分子“特異性結(jié)合”，形成“核酸—磁珠復(fù)合物”。在離液鹽(鹽酸胍、異硫氰酸胍等)的作用下。)和外磁場，復(fù)合物被分離。用洗脫液洗滌非特異性吸附的雜質(zhì)，脫鹽純化，得到提取純化的核酸近年來，隨著自動(dòng)化儀器的快速發(fā)展，基于磁珠法原理的全自動(dòng) 核酸提取儀由于能滿足實(shí)驗(yàn)室大批量樣品的需求，越來越多地應(yīng)用于核酸檢測。國產(chǎn)核酸提取儀品牌很多，比如Xi安天龍，樂普醫(yī)療。

磁珠法提取原理

核酸提取除磁珠純化外，還可采用硅膠膜離心柱法和溶液提取法。邊肖將幫助你了解這兩種方法的提取原理。

硅膠離心柱法:主要用于微量核酸的分離純化，利用裂解液促進(jìn)細(xì)胞破碎釋放核酸于細(xì)胞內(nèi)。由于硅膠模只對(duì)核酸有很強(qiáng)的親和力和吸附作用，而不吸附蛋白質(zhì)、多糖、脂類等其他生化成分，因此釋放的核酸被特異性吸附在硅膠膜上，而其他成分在離心過程中被甩出柱外。用洗脫液洗脫硅膠膜吸附的核酸，得到純化的核酸。該方法不僅成本低，而且提取質(zhì)量好。

溶液萃取:是最經(jīng)典的萃取方法，幾乎都使用有機(jī)溶劑如(SDS、CTAB、苯酚/氯仿)和鹽類如Tris、EDTA、NaCl等。除了提供合適的裂解環(huán)境，還包括抑制核酸 by 核酸酶(如EDTA)的破壞，維持核酸(如NaCl)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性等。有機(jī)溶劑使蛋白質(zhì)變性，破壞膜結(jié)構(gòu)，去除與核酸相連的蛋白質(zhì)，使核酸在裂解體系中解離。由于苯酚和氯仿有毒易揮發(fā)試劑、核酸、回收率低、損耗大、工藝復(fù)雜，已逐漸被吸附柱法和磁珠法取代。

PCR的大部分下游應(yīng)用對(duì)核酸的質(zhì)量要求不高，但需要一個(gè)快速的提取過程來縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率。市面上逐漸出現(xiàn)了各種核酸 fast 提取儀比如:全自動(dòng) 核酸萃取凈化器MolecisionMP-32可以在7分鐘內(nèi)快速萃取16-32個(gè)樣品。

二代測序中的應(yīng)用

在二代測序技術(shù)平臺(tái)的腫瘤基因檢測項(xiàng)目中，不同的采樣方式會(huì)產(chǎn)生不同的樣本類型，通常是血液樣本和組織樣本(包括新鮮組織、福爾馬林浸泡組織、石蠟包埋組織、石蠟線圈、石蠟切片等。).血液樣品需要經(jīng)過血漿分離步驟，并且可以在核酸提取之前分離白細(xì)胞和血漿樣品。白細(xì)胞提取方法和血漿提取方法完全不同，所以需要不同的提取試劑盒。根據(jù)保存方法的不同，標(biāo)本可分為福爾馬林浸泡組織和石蠟包埋組織。

白細(xì)胞提取原理:先破壞紅細(xì)胞，利用紅細(xì)胞和白細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)差異，先裂解紅細(xì)胞，離心后收集白細(xì)胞。之后，膜蛋白和核蛋白變性，白細(xì)胞溶解并釋放出游離DNA。通常，離子表面活性劑用于使蛋白質(zhì)變性。然后，去除變性的蛋白質(zhì)，將DNA留在上清液中。DNA在高鹽環(huán)境中從有機(jī)溶劑如無水乙醇中沉淀出來。

血漿提取原理:血漿DNA又稱循環(huán)DNA和游離DNA，是指血液中游離于細(xì)胞之外的DNA。主要來源是白細(xì)胞解體釋放的DNA，壞死組織特別是腫瘤組織釋放到血液中的DNA，以及感染的病毒。對(duì)于樣品少的實(shí)驗(yàn)室，優(yōu)選的核酸提取方法是離心柱法。原理是樣品裂解后，游離的DNA在高鹽下與硅膠膜結(jié)合，然后在低鹽高PH值下洗脫硅膠膜上的DNA。

新鮮組織提取的原理類似于白細(xì)胞提取的原理。只是預(yù)處理方法不同，組織提取需要消化。使用蛋白酶K和裂解物來消化組織并從組織細(xì)胞中釋放DNA。實(shí)驗(yàn)室為了達(dá)到較好的消化效果，通常會(huì)隔夜消化，以獲得高濃度的DNA。石蠟包埋組織的消化需要加入脫蠟劑脫蠟，然后進(jìn)行組織消化，提取DNA。

第三代測序中的應(yīng)用

SMRT測序是一個(gè)廣泛應(yīng)用的第三代測序技術(shù)，具有長閱讀長度的特點(diǎn)。為了滿足長閱讀的要求，提取高分子量的DNA是非常重要的。按照層析柱法和磁珠法，不容易獲得高分子量DNA。電泳技術(shù)可用于從微生物中提取高分子量DNA。

微生物超高分子量DNA提取原理:采用瓊脂糖包埋法，在微生物細(xì)胞懸液中加入瓊脂糖，裂解細(xì)胞，促進(jìn)DNA釋放。該方法提取的DNA經(jīng)電泳洗脫、凝膠切割和回收后，分子量可達(dá)300kb以上，將為第三代測序提供重要支持。

在核酸檢測中，提取和純化是影響檢測結(jié)果的重要因素，也是分子檢測的重要組成部分。受新冠肺炎疫情影響，全球及國內(nèi)市場對(duì)核酸提取純化試劑 box的需求持續(xù)上升，行業(yè)未來仍有較大發(fā)展?jié)摿?。在核酸萃取提純?cè)噭?box生產(chǎn)方面，國外公司前期占領(lǐng)了國內(nèi)市場。在新冠肺炎核酸檢測市場需求的推動(dòng)下,核酸提取純化試劑行業(yè)加速國產(chǎn)化進(jìn)程，國產(chǎn)品牌市場占比持續(xù)提升。目前，分子診斷中的核酸檢測占據(jù)主要市場，而生物芯片是未來的重要趨勢。