1.1

摘要

核酸是一個生物大分子化合物由許多核酸聚合而成，是生命最基本的物質之一。核酸廣泛存在于所有動物、植物細胞、微生物和生物體中核酸常與蛋白質結合形成核蛋白。不同的核酸，其化學成分、核酸排列順序都不同。根據化學組成的不同，核酸可分為核糖核酸，簡稱RNA和脫氧核糖核酸，簡稱DNA。

DNA是儲存、復制和傳遞遺傳信息的主要物質基礎，RNA在蛋白質的合成中起著重要作用，其中轉運核糖核酸，簡稱t RNA起著攜帶和轉運活性氨基酸的作用:m RNA是合成蛋白質的模板；核糖體核糖核酸，簡稱r RNA，是細胞合成蛋白質的主要場所。

1.2

核酸提取樣本

普通樣本:血液、動植物組織、細菌、細胞、病毒、骨髓、體液等。

問題:唾液、痰、土壤、糞便、毛發、石蠟包埋組織、骨骼、牙齒、指甲、煙頭等。

1.3

核酸提取方法

核酸包括DNA和RNA，兩者都是以與蛋白質結合的狀態存在于細胞中。核酸提取的主要步驟是:裂解細胞去除與核酸結合的蛋白質、多糖、脂類等生物大分子，去除其他不需要的核酸。沉淀核酸 純化 核酸，去除鹽類、有機試劑等雜質。

1.3.1堿裂解法

堿裂解法是基于DNA變性和復性的差異來達到分離目的。

1.3.2.煮沸法

煮沸時，樣品中的DNA pass 核酸裂解物被釋放出來。離心沉淀后去除雜質，上清液可用于PCR擴增。

1.3.3濃鹽法

由于RNA和DNA在電解質溶液中的溶解度不同，所以將兩者分開。常用的方法是用1M氯化鈉提取它們，用含有少量辛醇的氯仿搖勻DNP粘液，乳化，然后離心除去蛋白質。此時蛋白凝膠停留在水相和氯仿相的中間，而DNA位于上層水相，2倍體積為95。

1.3.4苯酚提取法

苯酚作為蛋白質變性劑，同時抑制脫氧核糖核酸酶的降解。當勻漿用苯酚處理時，由于蛋白質與DNA之間的鍵被打破，蛋白質分子表面出現許多類似苯酚的極性基團。分子溶于酚相，而DNA溶于水相。離心后，取出水層，重復操作多次，然后合并含有DNA的水相，利用核酸不溶的性質，用乙醇沉淀DNA。此時DNA是一種非常粘稠的物質，可以用玻璃慢慢繞成一團取出。這種方法的特點是將提取的DNA保持在自然狀態。

1.3.5水浸提法

利用核酸的水溶性，將組織細胞破碎，然后用低鹽溶液除去RNA，再將沉淀物溶于水，使DNA完全溶于水。離心后，收集上清液，向上清液中加入固體氯化鈉以將其調節至2。6M。加入2倍體積的95%乙醇，立即用攪拌法攪拌，然后用80%和95%乙醇和丙酸銅洗滌，*后在空氣中干燥，得到DNA sample。這種方法提取的DNA中蛋白質含量較高，一般不使用。為了去除蛋白質，可以對這種方法進行改進，在提取過程中加入SDS。

1.3.6陰離子洗滌劑法

DNA可用SDS或二甲苯鈉等去污劑使蛋白質變性，直接從生物材料中提取。因為細胞DNA和蛋白質之間往往是通過靜電引力或配位鍵結合，又因為陰離子去污劑可以破壞這種價鍵，所以經常使用陰離子去污劑萃取DNA。

1.3.7硅膠薄膜法

可用于手動提取或自動提取。

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硅膠模法核酸萃取

1.3.8磁珠法

生物磁珠是一種新型的功能化固體載體，表面包覆有活性基團，可與多種生物活性物質偶聯，具有液體流動性和固體磁性材料等特點，一般用于自動提取。它們可以在外磁場的作用下沿方向移動和停留，在去除外磁場后稍加振蕩或抽吸就可以均勻地分散在液體中，使固液相的分離變得非常快速和方便，通過簡單的洗脫就可以得到高純度的目標物。

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磁珠法核酸提取

1.4

提取純化方法比較

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1.5

提取核酸的目的

高質量地提取核酸分子的完整性和純度是下游分子生物學實驗的基礎。因此，高質量地提取核酸非常重要。他可以做很多很多的分子生物學實驗。下面簡單介紹一下常見的分子生物學實驗。

1.5.1個PCR

聚合酶鏈式反應(簡稱PCR)是一種分子生物學技術，利用擴增技術擴增特定的DNA片段。可視為特殊DNA體外復制。PCR(聚合酶鏈式反應)的原理是DNA在體外95℃變性會變成單鏈，在低溫下(一般在60℃左右)，引物會根據互補堿基配對的原理與單鏈結合，然后將溫度調整到DNA聚合酶的最適反應溫度(72℃左右)，DNA聚合。基于聚合酶的PCR儀實際上是一個溫控裝置，可以在變性溫度、復性溫度和延伸溫度之間進行很好的控制。

1.5.2轉基因

轉基因是將基因片段轉移到特定生物體內，最終獲得具有特定遺傳性狀的個體的技術。無論轉移的基因距離進化樹中的物種有多遠，接受者都可以讀取它，因為DNA是一個通用代碼，細胞知道如何讀取它。即使是關系最遙遠的物種，如人類和細菌，也有許多共同的基因，這些基因在數十億年的進化中保持不變。基因從哪里來不重要，發揮的是功能，所以轉入動物基因的植物不會有動物的味道。

轉基因技術的理論基礎來自于進化衍生的分子生物學。基因片段的來源可以是提取特定生物基因組所需的目的基因，也可以是人工合成的具有特定序列的基因片段。將基因片段轉入特定生物體內，與自身基因組重組，然后從重組體中人工選擇幾代，獲得具有特定遺傳性狀的個體。這項技術可以使重組生物增加人們所期望的新性狀，培育新品種。

1.5 .3基因文庫的構建

一個生物體的基因組DNA用限制性內切酶部分消化后，將消化的片段插入到載體DNA分子中，所有這些插入了基因組DNA片段的載體分子的集合體將包含該生物體的全部基因組，即構成該生物體的基因文庫。將這些載體引入受體細菌或細胞，使得每個細胞包含基因組DNA片段和載體重組DNA分子。經過繁殖和擴增后，許多細胞一起包含了生物體的全部基因組序列。我們稱這種集合體為基因庫。

利用重組DNA技術，將某一生物細胞的total DNA或染色體DNA的所有片段隨機連接到基因載體上，然后轉入合適的宿主細胞，通過細胞增殖形成每個片段的無性克隆(克隆)。當制備的克隆數量足夠大以包括某一生物體的所有基因時，整組克隆是相同的定義也適用于生物體的線粒體DNA或葉綠體DNA的基因文庫。因為制備DNA片段的分界點是隨機的，所以每個克隆中包含的DNA片段可能是一個或幾個基因、一個基因的一部分或除了完整基因之外的兩側相鄰的DNA序列。

1.5.4分子測序

用DNA聚合酶合成與模板互補的DNA鏈，在三維空間記錄模板位置和核苷酸序列信息，然后逆向構建模板的序列。除了DNA合成反應的三要素(模板、酶、核苷酸)外，反應循環中單色熒光標記的模板位置和核苷酸的序列(a、c、g、t如何)也是最終DNA序列要完成的關鍵要素。如果反應中使用的核苷酸標記了四種不同的熒光，就需要在每個反應循環中切換不同波長的光來記錄不同的堿基。

1.5.5分子診斷

分子診斷:利用分子生物學方法檢測患者體內遺傳物質的結構或表達水平的變化來做出診斷的技術，稱為分子診斷。分子診斷是預測性診斷的主要方法，既可用于個體遺傳病的診斷，也可用于產前診斷。用于分子診斷的材料包括DNA、RNA和蛋白質。

分子診斷主要是指檢測編碼與疾病相關的各種結構蛋白、酶、抗原、抗體和免疫活性分子的基因。

1.5.6親子鑒定

親子鑒定是運用法醫學、生物學、遺傳學的理論和技術，從子代與父母的形態結構或生理功能的相似特征來分析遺傳特征，確定父母與子女的生物學關系是否是法醫物證鑒定的主要組成部分。親子鑒定從中國古代就有了，比如血滴、骨滴。

DNA親子鑒定的操作步驟如下:

第一步:DNA提取

提取樣品細胞核中含有的DNA，然后進行一定的純化，去除樣品中的雜質。

第二步:PCR擴增

PCR的中文名字叫聚合酶鏈式反應。簡單來說，華科基因PCR擴增的步驟就是通過酶促反應，在PCR儀上大量復制出我們需要的片段，并放大到一些特殊儀器可以看到的程度。

步驟3:后PCR反應

這一步主要是ABI測序儀檢測的準備階段，在此階段打開雙鏈DNA并加入一些檢測用的內標，主要是標記檢測片段的長度。

步驟4:毛細管測序儀檢測。

由于DNA是帶電的，通過毛細管電泳，不同的片段DNA電泳速度不同，在相同的電壓和相同的電泳時間下，泳動距離不同，可以通過前期加入的內標測量來區分，并通過一定的軟件顯示在電腦上，方便檢測人員處理和分析數據。

第五步:分析數據，出具報告。

主要是檢測人員對結果進行分析、匯總、計算，然后做出鑒定結論和報告。

1.5.7法醫鑒定

司法鑒定是司法程序中技術工作的重要組成部分。它是運用醫學、生物學、人類學、物理學、化學等知識對活體、尸體以及與人有關的生物證據進行檢驗和鑒定。，從而得出死因、損傷程度、兇器類型、血型分析、事實確認等結論性意見。司法鑒定結論是三大訴訟法中的重要證據類型。由于與人身密切相關，司法鑒定在訴訟和非訴訟活動中具有重要意義。它是查明案件事實、區分案件性質的重要依據，也是鑒定案件中其他證據是否真實的重要手段。可以說，法醫工作的質量在一定程度上影響著司法公正。

1.5.8基因敲除

基因敲除是指一種基因工程技術，針對序列已知但功能未知的序列，改變生物的遺傳基因，使特定基因的功能失效，從而阻斷部分功能并進一步影響生物，進而推斷基因的生物學功能。

基因敲除和基因嵌入技術是20世紀90年代出現的*新外源DNA導入技術。基因敲除是一種基因打靶技術，類似于基因的同源重組。指外源DNA基因與受體細胞基因組中相同或相似序列的同源重組，從而替換受體細胞基因組中相同/相似的基因序列，并整合入受體細胞基因組。該方法能產生準確的基因突變，并能正確糾正生物體的基因突變。基因嵌入又稱基因置換，是利用內源基因序列兩側或外側的斷點，將內源基因替換為同源序列的目的基因。目前基因敲除和基因嵌入技術有Cre/Lox P系統、FLPI系統等。

1.5.9基因芯片

基因芯片(genechip，又稱DNA chip和生物芯片)的雛形于20世紀80年代中期提出。基因芯片的測序原理是雜交測序法，即核酸測序法通過與一組核酸已知序列的探針雜交，將8 核苷酸已知序列的探針固定在一個基片表面。當溶液中帶有熒光標記的核酸序列TATGCAATCTAG與基因芯片上相應位置的核酸探針互補時，通過確定熒光強度*強的探針的位置，可以得到一組序列完全互補的探針序列。據此可以重組target 核酸的序列。

1.5.10 .動植物資源保存鑒定

毫無疑問，建立瀕危野生動植物種質基因庫，實施瀕危動植物基因保護工程，對于我國瀕危野生動植物的保護和繁衍，對于維護我們賴以生存的環境生物多樣性和生態鏈平衡具有重要意義。然而，對于已經進入生物經濟時代的人類來說，其意義遠不止于此。

高質量核酸的提取在其他領域和方向也不容小覷。但是，僅僅依靠傳統的核酸提取方式，很難滿足日益龐大的中文核酸市場。所以全自動 核酸自動提取器的出現，會給中國核酸提取器市場帶來光明。